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研究发现,无证据表明6mdA存在于哺乳细胞中

N6-甲基腺嘌呤(6mdA)是细菌中广泛存在的DNA修饰,不过自2016年以来,发表在《Nature》、《Cell》等杂志上的多项研究证实,6mdA也存在于哺乳动物中,如小鼠胚胎干细胞、人类神经胶质瘤细胞。然而,现在事情又有了反转。

瑞典林雪平大学的研究人员近日在《Science Advances》杂志上发文称,之前那些表明6mdA存在于哺乳动物细胞中的研究很可能是污染了,而目前没有足够的证据表明这种修饰存在于哺乳动物中。

传统的观点认为,5-甲基胞嘧啶(5mC)修饰是哺乳动物中的甲基化形式。不过,2016年发表的一篇论文改写了这一理论,表明细菌中常见的6mdA修饰也存在于小鼠胚胎干细胞中。不过,其他几项研究却没有在小鼠胚胎干细胞中发现6mdA的存在。一时间,哺乳动物基因组中6mdA的研究迷雾重重。

之前的研究表明,6mdA在哺乳动物细胞谱系特化中具有潜在作用。为了进一步阐明其作用,研究人员在体外将人幼稚辅助性T细胞(NTH)分化成辅助性T细胞亚群。然而,与之前的研究相反,他们发现TH分化过程中6mdA的丰度并没有发生变化,并观察到分化T细胞中的6mdA水平与未甲基化的全基因组扩增DNA相同,这表明6mdA不存在于T细胞中。

他们还从6个人类细胞系中分离出DNA并分析6mdA水平,发现2个细胞系的6mdA水平高于背景噪声。出乎意料的是,这两个293T细胞系培养物却具有不同的6mdA水平,表明研究人员观察到的6mdA信号并非细胞本身所固有。

之后,他们进一步分析发现,这两个6mdA水平升高的细胞系被支原体污染,而支原体这种细菌本身富含6mdA修饰。当他们用支原体抗生素Plasmocin处理细胞系后,6mdA的信号降低至全基因组扩增(WGA)阴性对照的水平。

通讯作者Colm Nestor表示:“我们意识到,这些技术检测到的‘6mdA信号’只是噪声。不过,由于一些复杂的技术问题,几种方法中的背景噪声不是随机的,而似乎是真实信号。”

研究人员分析了以往通过DNA免疫沉淀测序、质谱和单分子实时测序检测哺乳动物细胞中6mdA的实验结果。他们发现,每种方法都存在局限性或缺陷,使得表观遗传标记的假阳性结果很高,这似乎印证了瑞典研究人员提出的6mdA不存在。

作者在文中写道:“我们表明,RNA和细菌污染、抗体交叉反应性及其他技术限制已经导致人们一而再地错误鉴定出哺乳动物DNA中的6mdA。”他们认为,在评估哺乳动物的6mdA水平时,细胞污染已成为一个特别复杂的问题,尤其是支原体。

“随着DNA和RNA修饰家族的不断扩大,未知修饰的丰度会越来越低,那么即使采用多种互补方法,也仍然存在错误鉴定的可能性。我们建议使用经过修饰和未经修饰的DNA标准品,作为今后研究罕见DNA修饰的最低标准,并在使用前全面验证抗体特异性。”

Nestor补充说,研究人员在研究罕见的现象时必须谨慎选择检测方法,并思考他们测量的东西是否真正存在。“现在,我们可以毫无疑问地说,6mdA并不存在于哺乳动物中,”他说。“如果人们停止研究根本不存在的东西,那么可节省大量时间和成本,同时也避免了失望

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