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看完这些你便知感受态细胞是如何制备得了
  感受态细胞(competent cell):理化方法诱导细胞,吸收周围环境中的DNA分子,使其处于适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
 
  主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。
 
  目前,感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温(0℃)时处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形,外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。转化效率可达106-107转化子/微克DNA。
 
  本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期,实验操作必须在低温下进行。
 
  操作:
 
  1、取-70℃冰冻菌种,用划线法接种细菌于培养皿,做好标记,于37℃培养过夜。
 
  2、第二天,从平板上挑取单个菌落,接种至含有3ml LB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中,37℃剧烈震荡培养约2~3小时(200~300r/min)
 
  3、当菌落600nm OD值达到0.3-0.4时,将烧瓶取出放置冰上10~15分钟。在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。4℃,4000g离心10分钟。
 
  4、弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中,振荡混匀,悬浮菌体,冰浴30分钟。
 
  5、4℃,4000g离心10分钟,弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液。加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体。每管0.2ml分装,至4℃保存备用,24-48小时内使用效果较好。如果暂时不用,可再保存于-70℃的低温冰箱中。
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