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柱式大RNA-miRNA双提试剂盒

柱式大RNA-miRNA双提试剂盒

简要描述:

柱式大RNA-miRNA双提试剂盒


英文名称:

运输:常温

保存:常温

有效期:1年

货期:现货

其他:

产品时间:2022-01-05

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柱式大RNA-miRNA双提试剂盒

产品介绍:

同时提取动植物大RNA(100nt以上)和小RNA(100nt以下)

柱式大RNA-miRNA双提试剂盒

产品及特点

1. 一款试剂盒两用,同时分离纯化大 RNA(mRNA、18S rRNA、28S

rRNA)和 miRNA(5S rRNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、

pri-miRNA、siRNA、shRNA 和 snRNA 等)。

2. 柱式连贯操作,比市场上的两步法(先分离总 RNA 再从中纯化其中的

miRNA)更简单快捷。

3. 适用范围广,可以用于动物组织、血液及部分植物组织等实验材料。

4. RNA 纯净,OD260/280 一般都在 1.9 以上。

5. 可用于 RT-PCR、miRNA 标记、microarray 等各种后续实验。

运输及保存 常温运输和保存,其中溶液 A 长期保存需要放 4℃,有效期一年。

自备试剂 绿仿。

使用方法 下列操作是从 100mg 样品中同时提取大 RNA 和 miRNA 的操作。如果只需

要大 RNA 或 miRNA,则不相关操作可以跳过。

一、通用步骤

1. 新鲜配制裂解液。将溶液 A 和溶液 B 按 1:1 的比例混合得裂解液,然后

根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意:溶液 A 和溶液 B

混合后必须立即使用,不要放置,否则会产生沉淀。

a) 对贴壁细胞:吸尽培养液,在每 10 平方厘米细胞中加入 1 mL 新鲜配制

的裂解液,用枪轻柔吹打数次,确保细胞全部裂解。

b) 对悬浮细胞:离心收集细胞,吸尽液体,在每 1-5×10E6 悬浮细胞中加

入 1 mL 新鲜配制的裂解液,用枪轻柔吹打数次,确保细胞全部裂解。如

果是 fibroblasts 或 carcinoma cell,1 mL 新鲜配制的裂解液的细胞使

用量不要超过 1×10E6 个细胞。

c) 对新鲜的动物组织:先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入 10

mL 或 15 mL 塑料离心管中,每 50-100 mg 组织加 1 mL 新鲜配制的裂

解液,用匀浆器匀浆 30 秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛

的组织(细胞中含大量正在复制的 DNA),建议组织的使用量不要超过

50 mg/ mL 裂解液,否则十分容易产生 DNA 污染。

d) 对新鲜的植物组织:先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入 10

mL 或 15 mL 塑料离心管中,每 50-100 mg 组织加 1 mL 新鲜配制的裂

解液,用匀浆器匀浆 30 秒左右。

e) 对非冻型组织 RNA 保存液保存的动物或植物组织:先用纸吸去保存液后

再剪切成小块,放入 10 mL-15 mL 塑料离心管中,每 50-100 mg 组织

加 1 mL 新鲜配制的裂解液,用匀浆器匀浆 30 秒左右。

2. 将裂解物转移至一个干净的 1.5 mL 塑料离心管中,然后加入 0.2 倍体积

的自备绿仿(1 mL 裂解物需 0.2 ml 绿仿),振荡器上充分振荡混均 30 秒。

3. 14000 g 室温离心 5 分钟。

4. 将上层水相(约 0.6-0.8 mL)转移到一个宽口离心吸附柱中以吸附大

RNA。注意:当样品的比重大时,可能上层是有机相,下层才是水相。两

相之间含有 DNA 和蛋白质,避免触及,否则将产生蛋白质和 DNA 污染。

5. 14000 g 室温离心半分钟,大 RNA 将与宽口离心吸附柱的膜结合,

miRNA 将存在于穿透液中。注意:由于离心吸附柱的吸附能力为 40

ug 动物 RNA,20 ug 植物 RNA,如果样品中的大 RNA 含量高于上面数

值,则大 RNA 也会进入穿透液,因此不要超载。

二、大 RNA 提取步骤

6. 加 0.7mL 通用洗柱液到宽口离心吸附柱中,14000 g 室温离心半分钟,

弃穿透液。

7. 再加 0.3mL 通用洗柱液到宽口离心吸附柱中,14000 g 室温离心半分钟,

弃穿透液。

8. 14000 g 室温离心半分钟以甩出残留液体。此步十分重要,否则残留的通

用洗柱液会影响大 RNA 的使用。

9. 将宽口离心吸附柱转移到一干净的 RNase-free 离心管中,加入 50uL

RNA 洗脱液。

10. 14000 g 室温离心半分钟,离心管中溶液即为大 RNA 样品,可以立即使

用(电泳、测 OD,RT-PCR 等)或存放于-80℃待用。

三、miRNA 提取操作

11. 在第 5 步所得的穿透液中加等体积的溶液 C,所得混合液总体积约为 1.5

mL),颠倒混匀。

12. 先转移 0.7mL 混合液到一窄口离心吸附柱中,室温静置 5 分钟。

13. 14000g 室温离心半分钟。注意:由于 miRNA 太短,挂膜效率较低,因

此大约有 30%左右的 miRNA 还在穿透液中,如果需要回收这些 miRNA,

可以将收集管中的穿透液转移到一新离心管中保存,稍后按附录的沉淀法

进一步回收。如果不需要则弃之。

14. 再转移 0.7mL 混合液到窄口离心吸附柱中,室温静置 5 分钟。

15. 14000 g 室温离心半分钟。将收集管中的穿透液和上步所得的穿透液汇

集,(如果需要回收其中的 miRNA)或弃之(如果不需要回收其中的

miRNA)

16. 加 0.7mL miRNA 洗柱液到窄口离心吸附柱中,14000 g 室温离心

半分钟,弃穿透液。

17. 再加 0.3mL miRNA 洗柱液到同一窄口离心吸附柱中,14000 g 室

温离心半分钟,弃穿透液。

18. 14000 g 室温离心半分钟以甩出残留液体。此步十分重要,否则残留的

miRNA 洗柱液会影响 miRNA 的使用。

19. 将窄口离心吸附柱转移到一干净的 RNase-free 离心管中,加入 30uL

RNA 洗脱液。

20. 14000 g 室温离心半分钟,离心管中溶液即为 miRNA 样品,可以立即使

用(电泳、测 OD,RT-PCR 等)或存放于-80℃待用。

附录 1:从第 15 步所得穿透液中用沉淀法回收残留的 miRNA

21. 将穿透液在 14000 g 室温离心 20-30 分钟。

22. 小心吸弃上清。注意不要碰及管内的离心面,miRNA 将在此面形成沉淀。

23. 加入 1mL 自备的 75%乙醇,14000 g 室温离心 5 分钟。。

24. 小心吸弃上清。注意不要碰及管内的离心面。

25. 14000 g 室温离心半分钟,小心吸弃残留液体,不要碰及管内的离心面。

26. 加入 20uL RNA 洗脱液吹打溶解管底和管壁的 miRNA 沉淀。所得溶液

即为 miRNA 样品,可以立即使用或存放于-80℃待用。

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