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柱式血液RNA提取试剂盒

柱式血液RNA提取试剂盒

简要描述:

柱式血液RNA提取试剂盒



英文名称:Column Blood RNAout

运输:常温

保存:常温

有效期:1年

货期:现货

其他:

产品时间:2020-03-25

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柱式血液RNA提取试剂盒

产品介绍:

柱式法纯化人类血液的总RNA

柱式血液RNA提取试剂盒

产品及特点 

本产品是在血液 RNA提取试剂盒基础上开发的柱式升级产品,

专门从动物全血样品中快速提取总 RNA。跟血液 RNA提取试剂盒 相比,本产品具有

下列特点:

1. 比血液 RNA提取试剂盒 更加简单快捷,直接使用新鲜的或冷冻的抗凝全血样品,

不需裂解红细胞等任何预处理步骤,整个提取过程只需要十分钟左右,

可以全在室温下进行。

2. 产量和纯度更高,OD260/280 均在 2.0 左右,产率一般为 2-5 ug/mL

人血。

3. 每次微量提取的样品处理量可以达到 1.5 mL,高于进口的同类产

品。

4. 与常用的抗凝剂(包括肝素,EDTA,柠檬酸钠,草酸钠)兼容,得到的

RNA 可以直接用于 RT-PCR 和 Northern 杂交等研究。

 

运输及保存 常温运输和保存,有效期一年。

自备试剂 绿仿。

使用方法 1. 将 0.2-1.5 mL 新鲜或解冻后的抗凝全血加入到 1.5 mL 塑料离心管中。

2. 12000-15000 g 室温离心 3 分钟,弃上清(血浆)。如果此时血液细胞沉

淀体积大于 0.2 mL, 则需要减少血液的使用量,具体减少量需根据具

体情况决定,因为各个个体(尤其是患者)血液中白细胞数目差别很大。

3. 将 1 mL 溶液 A 加入到血液细胞沉淀中,用移液枪充分吹打沉淀使细胞

裂解。

4. 将 0.3 mL 的溶液 B 加入到离心管中,剧烈震荡 30 秒。

5. 和 0.2 mL 绿仿加入到离心管中,剧烈震荡 30 秒。

6. 12000-15000 g 室温离心 3-5 分钟,将上清液(为无色或浅红色,约

0.5-0.9 mL)转移到另一干净离心管中。注意:转移的液体不要超过 0.7

mL,否则下一步不能加入等体积的溶液 C。为防止污染,留 100 uL

左右的上清液。下层有机相一般呈深红色,中间层为白色,含有 DNA,

蛋白质和其他细胞破碎物,避免触及或吸取。

7. 加入等体积的溶液 C,充分颠倒混匀。

8. 分两次将溶液转移到离心吸附柱中,每次转移后 12000-15000 g 室温

离心半分钟,弃穿透液。

9. 加 0.7 mL 通用洗柱液,室温离心半分钟,弃穿透液。

10. 如果有必要,可以再加 0.3 mL 通用洗柱液,室温离心半分钟,弃穿透

液。注意:增加此步可以进一步提高 RNA 的纯度。

11. 室温 12000-15000 g 离心半分钟。此步十分重要,否则残留的通用洗

柱液会影响 RNA 的后续反应。

12. 将离心吸附柱转移到一个自备的 RNase-free 的收集管中,加入 50-100

uL RNA 洗脱液,室温放置 1-2 分钟。

13. 12000-15000 g 室温离心半分钟,离心管中溶液即为 RNA 样品,可以

立即使用或存放于-80℃待用。

14. RNA 完整性的电泳检测:如果需要做 Northern 杂交,强烈建议用户使

用甲醛变性胶进行 RNA 电泳,因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子

(BioTechniques,28:414,2000)。

15. RNA 产量产率测定:将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之

间)检测其在 OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度(1

OD260 的 RNA=40 μg/mL),进而计算出 RNA 的产量(浓度 X 体积)

和产率(RNA 产量/组织用量)。人血 RNA 产率一般为 2-5 ug/mL。

16. RNA纯度测定:无污染的总RNA的OD260/OD280一般在2.0左右(具

体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关),高于此范围则分别表

示样品可能有蛋白质污染,但一般不影响 RT-PCR 等反应。

疑难解答 Q: 如何去除 RNA 样品中的 DNA 污染?

A: 可以使用非酶 DNA 清除剂 DNA ERASOL-2。

Q: 为何有的样品在第 6 步离心后有很厚的中间层,上清很少。

A: 这是因为蛋白质变性不充分,可以适当减少血液的用量。白细胞多的血液

容易产生这种情况。

Q: 离心吸附柱的 RNA 吸附量是多少?

A: 是 40 ug。

相关资料 血液 RNA 提取方法及注意事项

血液 RNA 提取的方法可以细分为需要预先处理和不需要预先处理两类。众

所周知,人和其他哺乳动物血液只有白细胞(不到总数的 5%)等少量细胞

含有 RNA,需要预先处理的血液 RNA 提取法其实就是分离白细胞再提取

RNA,本质上是白细胞 RNA 提取。分离白细胞的方法有 Ficoll-Hypaque

密度离心法(白细胞在 Buffy Coat 中)和红细胞裂解法。由于预处理操作会

剧烈改变血液 RNA 含量(British J. Haematol., 126:231, 2004),所

以无预处理提取法将是未来提取血液 RNA 的发展方向。

白细胞 RNA 提取和全血 RNA 提取都需注意以下问题:一、血液越新鲜越

好,因血液细胞内外都有大量 RNase,容易使 RNA 降解。血液在 4℃的放

置时间不要超过四天;二、尽可能抑制或灭活血液特有的 RNase(如

EDN, ECP),因为它们不但跟 RNase A 一样非常稳定,而且不被 RNase

Inhibitor 和 RVC 抑制,还能抑制逆转录酶的活性,它们残留在 RNA 样品

中不但会降解 RNA,还会干扰后续的 RT-PCR 反应;三,血液富含糖蛋白,

粘蛋白和血红蛋白,提取需要去除糖蛋白污染;四,由于 RNA 量少,提取时

很容易丢失,可以适当使用核酸沉淀助沉剂;五,血液细胞量随生理病理因

素变化波动性大,注意调整血液和提取试剂的用量。

 

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