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大提无内毒素质粒DNA提取试剂盒

大提无内毒素质粒DNA提取试剂盒

简要描述:

大提无内毒素质粒DNA提取试剂盒


英文名称:Endo-free Max Column Plasmid DNAout

运输:常温

保存:常温

有效期:1年

货期:1-2天

其他:

产品时间:2020-03-25

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大提无内毒素质粒DNA提取试剂盒

产品介绍:

碱变性法无内毒素质粒DNA大提,1次大提=20次小提

大提无内毒素质粒DNA提取试剂盒

产品及特点 

本产品是整合经典法大提质粒DNA提取和菌体内毒素清除

剂两产品而成。菌体内毒素清除剂在质粒提取前就把细胞壁上的内毒素清除掉,彻底避免了目前通用的先提取 DNA+内

毒素混合物,再从中纯化质粒 DNA 的弊端。用本产品提取的质粒 DNA,内毒

素的污染浓度低,适合于转染等对内毒素的污染敏感的实验。

1. 操作简单,只在经典的柱式质粒 DNA 提取前,增加菌体内毒素清除一步。

2. 去内毒素效果好,处理一次可以去除 99%以上的内毒素。

3. 质粒丢失少,产率只比柱式质粒 DNAout 低 5-10%,效果好于先提质粒

DNA,再用液相内毒素清除剂处理的方法。

4. DNA 可以直接用于转染等实验。 

两独立产品的组合。

运输及保存 RNase A 溶液需要低温运输、-20℃保存,其余成分可常温运输、室温或保存,如有沉淀可加热溶解后再使用。 自备试剂 50 mL 收集管

使用方法 1. 用 50 mL 塑料离心管收集不超过 40 mL 的 E.coli 饱和菌液,5,000 rpm

离心 5-10 分钟,弃上清,得到细菌沉淀。

2. 加入 10 mL 菌体内毒素清除剂,温和混匀后 5,000 rpm 离心 5-10 分钟,

弃上清(含内毒素)。一次洗涤可以去除细菌表面 99%的内毒素。

3. 再重复上述操作 1-3 次,得到的菌体将丢失了绝大部分细胞表面的内毒素。

4. 往细菌沉淀中加入 5 mL 溶液 A(使用时需要将 RNase A 溶液全部

加入并混合均匀,未用完的部分放 4℃保存),充分振荡悬浮。注意:充分

重悬细胞沉淀(无块状物)对于获得高的质粒产量十分重要。

5. 加 5 mL 溶液 B,温和翻转 10 余次至透明。若混合液不透明,应减少细

菌的用量或室温放置 5-10 分钟直到裂解液变透明。注意: 避免剧烈振荡,

否则细菌基因组 DNA 将断裂为小片段,与质粒难以分离,污染质粒 DNA。

6. 加入冰浴的 7 mL 溶液 C,颠倒混匀,冰上放置 10 分钟。混合物中将有

白色絮状物形成。注意不要过分振荡。

7. 6000 rpm 离心 10 分钟。如果离心管承受能力强,离心速度还可以适当

提高以充分沉淀絮状物。

8. 将上步得到的上清液移入到大提离心吸附柱中,放入 50 mL 收集管中。室

温放置 5 分钟左右以便让质粒 DNA 跟膜结合。

9. 6000 rpm 离心 5 分钟,质粒 DNA 将与大提离心吸附柱中的膜结合。弃

穿透液。

10. 将 10 mL 通用洗柱液加入到离心吸附柱中,室温静置 2 分钟后 6000 rpm

离心 5 分钟,弃穿透液。

11. 重复上步一次。

12. 室温 6000 rpm 空甩 5 分钟,弃穿透液。注意:此步很重要,不能跳过,

否则残留乙醇会影响后续实验。

13. 将大提离心吸附柱放入一个干净的 50 mL 塑料离心管中,加 0.5 mL DNA

洗脱液 2.0(洗脱液如加热到 50-65℃效果更佳),室温静置 2 分钟后

6000rpm 离心 5 分钟,收集液即是质粒 DNA 溶液。

14. 重复上步 3-4 次可洗脱更多的质粒 DNA。DNA 洗脱液 2.0 不够可以用 TE

或超纯水替代。

15. 合并所得质粒 DNA,立即使用或-20℃储存。 注意事项

1. 细菌培养时间一般为 12-16 小时,但接种量大时应减少时间。过度培养

会降低质粒的质量甚至导致质粒 DNA 突变。

2. 注意溶液 A:溶液 B:溶液 C 的比例为 5:5:7。若细菌量增大,需按比

例放大这些溶液的使用量。

3. 随菌体增多应延长溶液 B 的作用时间,直至溶液成粘稠透明状。但时间过

长会导致质粒 DNA 变性。

4. 加溶液 C 后形成的白色沉淀中有变性的蛋白质、细菌基因组 DNA 和细胞

碎片,离心后应避免带入到后续处理中。

5. 通用洗柱液洗涤离心柱后必须甩干一次,否则残留通用洗柱液中的乙醇会

干扰后续实验。

6. 质粒的具体产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相

关。一般 1.5 mL 过夜培养菌体可收获约 10 ug 高拷贝质粒。

7. 纯化的质粒在电泳中表现为 2-3 条带有时甚至为 4-6 条带均属正常,未

分开的环套质粒,易被误判为基因组 DNA。

 

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