欢迎光临上海钦诚生物科技有限公司
主页 > 产品中心 > > DNA提取纯化 > QC180702-5柱式植物线粒体DNA提取试剂盒
产品中心
柱式植物线粒体DNA提取试剂盒

柱式植物线粒体DNA提取试剂盒

简要描述:

柱式植物线粒体DNA提取试剂盒


英文名称:Plant Mitochondria DNA Purification Kit

运输:常温

保存:常温

有效期:1年

货期:1-2天

其他:

产品时间:2020-03-25

打印当前页

分享到:

产品介绍:

提取植物线粒体DNA

柱式植物线粒体DNA提取试剂盒

产品及特点 

植物线粒体是重要的植物细胞器,负责 ATP 的产生。此外植物很多重要的特性(如

雄性不育)也跟线粒体相关,是母系遗传研究的重要材料。对植物线粒体进行遗传研究

需要进行线粒体DNA纯化。本产品就是专门用于植物细胞线粒体DNA纯化的试剂盒,

柱式植物线粒体DNA提取试剂盒具有下列特点:

1. 即用型试剂盒,用户不需要单独配制各种溶液。

2. 提供粗提和精提两种操作方案,粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进

行线粒体粗提,所得线粒体含少量其他细胞器污染,可用于后续的 PCR 级别的

线粒体 DNA 提取。

3. 精提利用冷冻超速离心(离心力达 40000g)制备的密度梯度来将粗提制备的线

粒体和其他细胞成分进一步分开,得到线粒体精提液,适用于后续的测序级别的

线粒体 DNA 提取。

4. 本产品足够 5 次提取,每次可处理 10g 绿色植物组织(可得 1-2.5 mg 左右线粒

体)或 20g 非绿色植物组织(可得 2-5 mg 左右的线粒体)。

 

自备试剂 超纯水、5 M KOH(调 pH 用),25mM MgCl2溶液、0.5M EDTA 溶液、绿仿、异

丙醇、75%乙醇、TE 缓冲液或超纯水。

使用方法 注意:线粒体膜对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行,所用植

物组织,器皿和溶液均需要在 4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过 4℃。

一:选择植物组织

1. 植物组织不同,线粒体产率不同,请以下表为参考:

植物组织种类 线粒体产率 说明

根和块茎 0.3 mg/10g 如土豆,红薯等

黄化苗(下胚轴、子叶、胚芽鞘) 2-5 mg/10g 多酚含量低于叶片

有光合作用的叶片和子叶 1-2.5 mg/10g 需放置在暗处 3 天

2. 一般纯化选用黄化苗。如果用绿色组织(如叶片),需将植物提前放在暗室

至少 3 天以降低淀粉含量,否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。

3. 一次实验需要 10g 绿色植物组织(或 20 g 干净的非绿色植物组织)、40 mL 匀

浆液、约 90 mL 洗涤液和 35 mL 密度梯度离心介质(密度梯度离心介质的配制

方式是一次性将 9.8g =8.7mLPercoll 加入到 26.3mL 本试剂盒提供的离心介质

溶液中,充分混匀后得到 35mL 密度梯度离心介质)。上述三种溶液用前均需要

加入 BSA 干粉使其终浓度为 0.1%(100mL 溶液加 0.1g BSA 干粉,轻柔颠倒

混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用)。每次实验用多少配多少,不要预先将所有

BSA 干粉加入,否则容易长菌。

二:线粒体粗提操作流程

4. 将 10 g 的绿色植物组织(去叶脉后的嫩叶子、愈伤组织)或 20 g 干净的非绿色

植物组织(如发芽组织、根、块茎等)浸泡在冰水中 10 分钟,取出用纸吸干液

体后浸泡在预冷的 40 mL 匀浆液(已加 0.1% BSA)中,在浸泡状态下剪成 1cm2

大小的碎片。注意:处理样品量太大的话线粒体产率会急剧降低,所以如果同一

样品太多可分成多组平行处理,得到线粒体粗提物后再汇集,

5. 将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到 Waring 匀浆器中,中速匀浆 3 次,每次

15 秒,每次之间间隔 10 秒以便让碎片沉淀到刀片处。也可使用研磨法,具体操

作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中,研磨 3-4 分钟。注意:

植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化,降低 pH,而线粒体对 pH 变化非

常敏感,因此建议匀浆后用 pH 试纸检测匀浆液的 pH,如果低于 7.0,必须用自

备的 5 M KOH 将 pH 调到 7.0 以上才进入下一步。

6. 用带柄尼龙筛过滤匀浆液,穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的 50 mL 的塑

料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。

7. 在低速固定角度冷冻离心机上 4℃ 1000 g 离心 5 分钟,沉淀为未破碎的细胞、

破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒,上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷

的 50mL 塑料离心管中。

8. 将装上清的离心管在水平冷冻离心机上 4℃ 12,000 g 离心 20 分钟,弃上清液,

所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀,

属于正常现象。

9. 加入 10 mL 预冷的洗涤液(已加 0.1% BSA,下同)中,用软毛笔轻柔重悬线

粒体沉淀(如果底下有白色淀粉沉淀,需要避免重悬之)。不能剧烈震荡,否则

线粒体容易破裂。

10. 将线粒体重悬液转移到新的 50mL 离心管中,再加入 30mL 预冷的洗涤液,4℃

1000 g 离心 5 分钟。线粒体将在上清中。

11. 将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中,4℃ 12000 g 离心 20 分钟,沉淀为

线粒体。小心弃上清。到此步时,线粒体回收率一般在 15-30%。

12. 在沉淀中加入 2 mL 预冷的洗涤液。用软毛笔轻柔重悬,得到线粒体粗提液。如

果有平行提取,可将最多 4 管线粒体沉淀重悬在 2 mL 洗涤液中。线粒体粗提液

中线粒体的回收率一般在 45-75%。

13. 在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴 50uL 左右的线粒体

粗提液到载玻片上,再滴入 50 uL 詹纳斯染液绿 B 染色液 20 分钟,油镜下观察,

蓝绿色颗粒状物即为线粒体。

14. 所得线粒体粗提液含其他细胞器(如类囊体膜, 质体, 过氧化物酶体, 乙醛酸循

环体,或细菌)污染,但可直接用于 PCR 级线粒体 DNA 和 RNA 的提取。如果需

要长期保存,则直接放-80℃保存。如此保存的线粒体 DNA 完整性在几年内都不

会发生变化。

三:细胞核 DNA 的去除(纯化测序级的线粒体 DNA 才需要进行此操作)

15. 预留 50uL 线粒体粗提液做对照,在约 2 mL 剩余的线粒体粗提液中加入 40 uL

25mM 自备的 MgCl2,再加入 0.2mg DNase 干粉,混匀后冰上放置 60 分钟

降解 DNA。取少量样品(如 50uL)在 PCR 仪器中加热到 95℃变性 10 分钟灭

活 DNase,再取其中的 10uL 和 10uL 预留的样品一起进行细胞核基因专一性

PCR(需要用户自己设计引物和自备 PCR 试剂),如果 DNase 处理过的样品没

有扩增,而预留样品有扩增,则表明 DNA 去除比较干净(达到 PCR 检测的极限),

则进入下一步。如果未去除干净,则继续在冰上放置,直到 PCR 检测不到细胞

核 DNA。

16. 加入 0.32 mL 预冷的自备 0.5M 的 EDTA 溶液和 40mL 预冷的洗涤液。

17. 4℃ 1000 g 离心 5 分钟,将上清转移到新的预冷的 50mL 离心管中,4℃ 12000

g 离心 20 分钟,沉淀为去除细胞核 DNA 的线粒体。重悬在 2mL 洗涤液中。

18. 在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴 50uL 左右的线粒体

粗提液到载玻片上,再滴入 50 uL 詹纳斯染液绿 B 染色液 20 分钟,油镜下观察,

蓝绿色颗粒状物即为线粒体。

四:线粒体精提操作方案(需要 40000g 的超速冷冻离心机)

19. 在 50 mL 预冷的塑料离心管中先后加入 35 mL 预冷的密度梯度离心介质(配制

方法见第三步,用前需先加 0.1% BSA)。

20. 将 2 mL 线粒体粗提物重悬液铺在密度梯度离心介质上。

21. 在超速水平离心机上 4℃ 40,000 g 离心 45 分钟,最上层为黄色或橙色的质体

带(如果材料是绿色植物,此带将是绿色),其下的白色不透明的带即为线粒体,

管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下:

22. 用广口吸管(可将 1 mL 蓝抢头中间剪断后使用)收集线粒体带,注意避开其上

的质体带过氧化物酶体沉淀,估计所取含线粒体溶液的体积。

23. 在 15-20 分钟的时间内缓慢加入至少 4 倍体积的预冷的洗涤液。

24. 转入 50 mL 塑料管离心管中,在冷冻离心机上 4℃ 15,000 g 离心 20 分钟,沉

淀为线粒体。可以直接进入第 25 步进行 DNA 提取。如果暂时不提取 DNA,则

把线粒体沉淀放-80℃保存。

五:线粒体 DNA 的提取

25. 在线粒体沉淀中加入 600 uL 预热的细胞器 DNA 提取溶液 A,用移液枪充分吹

打均匀。

26. 再加入 150 uL 65℃预热的细胞器 DNA 提取溶液 B,颠倒数次混匀。此时溶液

中可能有白色丝状悬浮物产生。由于溶液 B 比较粘稠,可以采取称量方法取用,

150 uL 约等于 150-160 mg。也可以将 1 mL 枪头剪去一截再吸取。

27. 65℃放置 5 分钟。不能室温放置,否则 DNA 产量会降低 10-20%。

28. 加入 200 uL 自备绿仿,涡旋震荡混匀 30 秒,此时溶液将呈乳白色。

29. 14000 g 室温离心 2 分钟。此时上清液将变得透明,中间层有白膜。小心转移上

清液到一个新的 1.5 mL 塑料离心管中,避免触及中间层的白膜。

30. 加入 1 倍体积(约 750 uL)的异丙醇到上清液中,用手上下颠倒 30 秒混匀。此时

一般将有絮状 DNA 沉淀出现。

31. 14000 g 室温离心 3 分钟。此时管底将有微小 DNA 沉淀,小心弃上清,注意不

要丟弃 DNA 沉淀。

32. 在离心管中加 1 mL 75%乙醇,短暂震荡,14000 g 室温离心 3 分钟,弃上清。

33. 重复上述 75%乙醇洗涤操作一次。

34. 短暂离心,小心吸弃残留的液体(约 50 μL)。此步不要省略,否则残留的液体

(含乙醇)将会影响 DNA 电泳、酶切很 PCR 等反应。

35. 立即加入 50-100 μL TE 缓冲液或超纯水充分溶解线粒体 DNA 沉淀。

36. 直接取 5-10 uL 电泳检测 DNA,再测 OD 计算浓度和纯度,其余样品放-20℃

保存备用。

 

留言框

  • 产品:

  • 留言内容:

  • 您的单位:

  • 您的姓名:

  • 联系电话:

  • 常用邮箱:

  • 详细地址:

  • 省份:

  • 验证码:

    请输入计算结果(填写阿拉伯数字),如:三加四=7
  • ©2020上海钦诚生物科技有限公司版权所有 技术支持:化工仪器网
  • QQ号码:597467067 邮 箱:shqcsw01@163.com 地 址:上海市宝山区长江西路2351号2楼8室-8 备案号:沪ICP备19009120号-2 总访问量:14989
在线客服 联系方式

服务热线

18121034793