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丝状真菌线粒体DNA提取试剂盒

丝状真菌线粒体DNA提取试剂盒

简要描述:

丝状真菌线粒体DNA提取试剂盒


英文名称:Filamentous Fungal Mitochondrial DNAout

运输:常温

保存:常温

有效期:1年

货期:1-2天

其他:

产品时间:2020-03-25

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丝状真菌线粒体DNA提取试剂盒

产品介绍:

提取真菌线粒体的DNA

丝状真菌线粒体DNA提取试剂盒产品及特点

 线粒体是重要的、负责能量产生的极其重要的细胞器。对丝状真菌线粒体进行生

化,遗传和分子生物学研究都需要先进行线粒体纯化。本产品就是基于密度梯度离心

的,专门用于从丝状真菌叶片中纯化完整线粒体、再从中纯化线粒体 DNA 的试剂盒。

它具有下列特点:

1. 即用型试剂盒,用户不需要单独配制各种溶液。

2. 所得线粒体可用于后续的 SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白组分析、线粒

体 DNA 和线粒体 RNA 纯化。

3. 本产品足够 15 次线粒体纯化和 15 次线粒体 DNA 提取,每次可处理 10-20g 菌

丝体,能得到 1-5 mg 左右线粒体。

4. 已经成功用于 Aspergillus candidus、Aspergillus nidulans、Magnaporthe

oryzae 、 Neurospora crassa 、 Penicillium chrysogenum 、 Rhizopus

stononifer 等丝状真菌。

 

运输及保存 常温运输和保存, 保存期限一年。

自备试剂 去离子水、绿仿、异丙醇、75%乙醇、TE。

使用方法 注意:纯化 DNA 提取用的线粒体的要求比纯化功能研究用的线粒体的要求要低,但

整个操作还是在冰上或者在冷室进行,所用器皿和溶液在 4℃预冷,离心要在 4℃进行,离心力以 g 而不是 rpm 计算。

一:菌丝的摇瓶培养

1. 使用合适的丝状真菌培养基,接种孢子至终浓度为 2×10E6/mL。一般 100 mL

液体培养基可以得到 0.8-1.2g 菌丝体,而本方法一次可以处理 10-20g 菌丝体,

故一次培养 1-2 升。

2. 在合适的温度(如 25℃、30℃或 37℃,根据真菌不同而不同)250rpm/min

摇晃培养 16-20 小时。

3. 用多层纱布或多层过滤纸过滤收集菌丝,用冰浴的自备去离子水洗涤菌丝三次去

除残留的培养基。

4. 用吸水纸吸干菌丝的水分,称重后立即使用。如果在-80℃或液氮长期放置,线

粒体回收效率将减低。

二:线粒体粗提液的制备

5. 制备溶液 A 工作液:每次提取需 150mL 溶液 A 工作液,制备方法是将 20mL

溶液 A 和 130mL 自备去离子水混合,冰上预冷即可。

6. 在 200mL 烧杯中,加入 100mL 预冷的溶液 A 工作液,再加入新制备的菌丝体,

然后全部转移到 Waring 匀浆机(家用果汁匀浆机)中,低速匀浆 10 秒,避免

起泡沫。用玻璃棒把菌丝按入匀浆机底部后,再低速匀浆 10 秒。注意:还可以

选择 Dounce 玻璃匀浆器,Polytron 匀浆机和研磨(加玻璃珠)等方法,但它

们单次处理量一般都较小,需多份处理再汇集。

7. 用带柄尼龙滤膜过滤匀浆液,用预冷的 200 mL 量筒收集穿透液。

8. 将剩下的菌丝体转移到 Waring 匀浆机中,再加入 40 mL 预冷的溶液 A 工作液,

低速匀浆 10 秒,用上步的带柄尼龙滤膜过滤,用预冷的 200 mL 量筒收集穿透

液。注意:带柄尼龙滤膜后可反复使用。

9. 将穿透液分到 4 个预冷的 50 mL 的塑料离心管中(每个约 35 mL)。

10. 在水平转子离心机上 4℃ 4000 g 离心 10 分钟,小心转移上清(含线粒体的部

分)到 4 个新的离心管中。沉淀含细胞核和未裂解的细胞,可以弃之不用。如果

要用于纯化细胞核 DNA,则可以放-80℃长期保留。

11. 将含上清液的 4 个离心管在 4℃ 10000 g 离心 20 分钟。

12. 每个离心管中加 2.5mL 预冷的溶液 A 工作液重悬线粒体沉淀并汇集(共约 10

mL),此为线粒体粗提液。

13. 如果直接用线粒体粗提液提取线粒体 DNA,容易有细胞核 DNA 污染。具体步骤

是:在水平转子离心机上 4℃ 10000 g 离心 7 分钟,小心弃上清,沉淀为线粒

体,直接用于第三步的线粒体 DNA 提取。

14. 如果需要高纯度、无污染的线粒体 DNA,则需要用密度梯度离心法将完整的线

粒体和其他细胞碎片进一步分离。具体见下步线粒体精提液的制备。

三:线粒体精提液的制备(密度梯度离心法)

15. 制备重液和轻液:将 4.1 克成分 B 干粉加到 6.3 mL 溶液 C 中,充分摇晃混匀

得 10 mL 重液。将 4.1 克成分 B 干粉加到 6.3 mL 去离子水中,充分摇晃混匀

得 10mL 轻液。

16. 在 50 mL 塑料离心管中先加入 10 mL 重液,再在其上轻轻加上 10 mL 轻液,

加上第 11 步所得的约 10 mL 线粒体粗提液。

17. 加平衡离心管后在水平转子冷冻超速离心机上 4℃ 43000 g 离心 2 小时,重液

和轻液间的带为完整线粒体。

18. 用广口吸管小心将线粒体转移到新的离心管中,加入等倍体积的预冷的溶液 C,

轻柔混匀。取少量在相差显微镜下检查线粒体完整性。

19. 在水平转子离心机上 4℃ 19000 g 离心 20 分钟,小心将上清吸出后,线粒体沉

淀可以直接用于 DNA 提取。

四:线粒体 DNA 提取

20. 将 600 uL 通用线粒体 DNAout 溶液 A 加入到上步得到的线粒体沉淀中并吹打

混匀,然后转移到 1.5 mL 离心管中。

21. 65℃放置 5 分钟。

22. 加入 300 uL 通用线粒体 DNAout 溶液 B,震荡混匀 10-30 秒。注意:溶液 B

非常粘稠,可以将其预热到 65℃并剪掉一截枪头后再取。

23. 加入 200 uL 自备的绿仿,震荡混匀 10-30 秒。

24. 12,000 g 室温离心 3 分钟。此时上清液将变得透明,中间层有白膜。

25. 小心转移上清液(约 0.8 mL)到一个新的 1.5 mL 离心管中,避免触及中间层

的白膜,可留少量上清不取。

26. 加入 1 倍体积的自备异丙醇,颠倒 30 次混匀。

27. 12,000 g 室温离心 5 分钟,小心弃上清液。

28. 在离心管中加入 1 mL 自备的 75%乙醇,震荡 30 秒。

29. 12,000 g 室温离心 1 分钟,小心弃上清液。

30. 12,000 g 室温离心半分钟,残留液体将汇集在管底。

31. 用洗液枪吸弃管底残留液(约 50 uL)。

32. 加 50-100 uL 自备的 TE 缓冲液,溶解 DNA 沉淀即得线粒体 DNA 溶液。直接

取 5-10 uL 电泳检测,其余放直接使用或放-80℃冰箱备用。

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